続・HPLC分析のコツ（5） 移動相溶媒中の添加剤

移動相として使用する有機溶媒には、化学的に不安定な溶媒（クロロホルム、ジクロロメタン）があり、安定剤が入っている場合があります。このような溶媒は、含まれる添加剤により分離や検出に影響を与えることがあり、使用方法に注意が必要です。

右図は、テトラヒドロフラン（THF）のUVスペクトルです。THFには、安定剤（酸化防止剤）として、ジブチルヒドロキシトルエン（BHT）が添加されているものがあります。そのため、添加剤を含有しているTHFは、280nm付近にUV吸収があり、UV検出器を使用したときの検出波長に注意が必要です。
また、添加剤の充填剤への吸着などの問題から、逆相や順相クロマトグラフィーでは安定剤が入っていないTHFを利用してください。安定剤なしのTHFは、容器の蓋を開けると時間とともに酸化し、UV吸収が増加するので注意が必要です。

未開封の場合、THFはおおよそ2年間は保存することが可能ですが、開封後は劣化するので、窒素ガスを封入し、暗所で保管することが必要になります。（試薬メーカによって、推奨される保管方法が異なりますので、確認が必要です）
安定剤なしのTHFは、開封後は速やかに使用し、使い切ってしまうことが理想的です。

続・HPLC分析のコツ（4） 移動相に発生するカビ、バクテリア

移動相にリン酸塩や酢酸塩水溶液などを使用し、混合されている有機溶媒の量（10％以下は注意）が少ない移動相溶媒は、カビ、バクテリアの発生に注意する必要があります。特に温度や湿度の高い夏場では、2、3日でも微生物が移動相溶媒中に発生することがあります。溶媒ビンの中で数日経過した移動相溶媒中に浮遊しているものがあるときは、微生物の発生かもしれません。

このような微生物が発生した場合は、ポンプの送液不良、流路内汚染によるゴーストピークの発生、カラムの劣化、インジェクタの不具合、セルの汚染などによるベースラインノイズの増大や変動といったトラブルの原因になります。

図は、溶離液中に発生したカビが付着したインレットフィルタの写真です。

図　新品（上）とカビの付着した（下）
インレットフィルタ

微生物の発生を防ぐには、移動相溶媒を入れているビンの洗浄、乾燥を行い、移動相溶媒の継ぎ足しは行わずにできるだけ短時間で使い切るか、残った溶媒は廃棄するようにしましょう。

また、カビの発生しやすい移動相溶媒をHPLCシステム内に残したまま保存しないでください。有機溶媒と水の50/50（例　アセトニトリル/水、メタノール/水）などの溶媒で流路を置換しておくことが予防策になります。

続・HPLC分析のコツ（3） ゴーストピーク対策（フタからの混入）

オートサンプラーのサンプルビンは、様々な形状、容量、フタ（シール）を有しています。特にシールの材質、プレカットの有無は、試料溶媒を考慮して適切なものを使用する必要があります。適切ではないものを使用した場合、ゴーストピークの原因になりことがあります。

図　サンプルビンのシールの添加剤が混入

例えば、試料溶解溶媒にn-ヘキサンや酢酸エチルなどの有機溶媒を使用し、一つのサンプルビンから複数回、注入、測定を行うときは注意が必要です。

シリコン樹脂などが使用されているフタを使用した場合、これらの溶媒では、一回目の測定後にニードルの外壁に付着した溶媒がシールのシリコン樹脂に付着、溶解し、2回目の測定時に試料溶液に溶け込み、ゴーストピークとなることがあります。

このような場合、テフロン系樹脂のフタを使用することで、ゴーストピークの出現を防ぐことができます。

続・HPLC分析のコツ（2） 空気トラップ

ゴーストピークが出現する前回の話題の続きです。前回は、溶離液に使用している水や試薬中の成分がゴーストピークの原因だった場合の対処法でした。今回は、HPLCシステムを設置している実験室内の空気中に含まれる成分が原因だった場合の対処法についてお話します。

実験室内では、アンモニアやアルデヒド類など揮発性物質を取り扱うことがあります。このような成分が移動相（溶離液）に溶け込み、これが原因でゴーストピークの発生やベースラインの変動等のトラブルを発生することがあります。

図　空気トラップ

このような場合、図のように溶離液の瓶に流入する実験室の空気をトラップ溶媒に一度通過させることで、揮発性物質を取り除くことができます。図のようにすることで、溶離液が減った際に入り込む空気は、トラップ後の空気になるため、溶離液に揮発性物質が溶け込むのを防ぎます。このような対処で、ゴーストピークを消失できる場合があります。

なお、トラップ溶媒は成分の性質によっても異なりますが、移動相溶媒と同じ溶媒を入れておくのも一つの方法です。トラップ容器側の溶媒に入れているチューブの先に焼結タイプのフィルタを付けておくことにより、空気中の成分除去に高い効果が得られます。

続・HPLC分析のコツ（1） ゴーストピーク対策 －クリーンアップカラムの利用－

グラジエント溶出法を使用したHPLC測定では、以下のような理由でゴーストピークが出現し、目的成分の検出を妨害することがあります。このような妨害成分を除去することで、より精度の高い測定結果を得られることがあります。

・劣化した水の使用
・緩衝液として使用した試薬に含まれる微量の不純物
・ポリ瓶から溶出された可塑剤
・周囲の空気中成分の移動相への溶解

クリーンアップカラムは、高圧混合グラジエント溶出法において、溶出力の弱い移動相溶媒を送液しているポンプの出口側に接続することで、溶媒中のゴーストピークの原因となる成分を吸着し、ピークを低減させることが期待できます。

図 水の送液ポンプ出口にクリーンナップカラム、接続前（上）と接続後（下）のデータ

左図は、クリーンアップカラムを使用する前のクロマトグラムです。大きなゴーストピークが観測されています。一方、水の送液ポンプの出口にクリーンアップカラムを接続して測定したデータが、右図になります。ゴーストピークが消滅していることが良くわかります。

■詳しくは
日本分光HP－Clean up Column