HPLC分析のコツ（10） 緩衝液の話１

今回は緩衝液についてのお話です。

疑問１、なんの濃度？
緩衝液の濃度が、緩衝能を示す弱酸、弱塩基の量を示すことは知っています。 ピリジン-酢酸の場合には、pHに関係なく、ピリジンの濃度をさすという例外があることも知っています。 ここで困ってしまうのが、よく使うリン酸です。

例えば、10mM NaH₂PO₄の場合、pH6.5のときの10mMというのは、リン酸の濃度のことです。 ところが、pH2.5の緩衝液では、10mMは、Naの濃度をあらわしているのです。 同じリン酸緩衝液で、違いがあります。 どっちのpHでも、はじめは10mM分のNaH₂PO₄･2H₂Oを水に溶かします。 この時のpHは4.5くらいです。pHを6.5にするには、NaOHを加えます。 2.5にしたいときは、リン酸でpHを調整します。もうわかってしまいましたね。 pHにより加えるものが違ってくるので、濃度を示すものも変わってしまうのです。 「pH2.5のときには、はじめにリン酸を10mM分計っておけばいいじゃないの」 と思われるかもしれませんが、それはできません。 10mMはかりとるようなリン酸というものが無いからです。 市販のリン酸は、約85%の水溶液です。これじゃ、簡単に10mMなんて作れませんよね。

疑問２、0.2％リン酸はどうやって作ったの？

図 リン酸二水素ナトリウム

クロマトグラフィーの条件をみていると、0.2%リン酸というのが出てきます。 実際作るときになってみると、 「これはリン酸の濃度で0.2％なのかな？」 「85％リン酸が0.2％入っているということなのかな？」 「この％はW/Wなのか、W/Vなのか？」 論文の中に使われていたとき、多くの人はリン酸濃度0.2%(W/V)だと理解すると思います。 問題は、オペレーターがどうやっているかということですが。

この問題に対しては、3通りの作り方がされていると思います。

①約85%のリン酸を425倍に希釈する方法(0.2%,W/V）
②85%リン酸はW/Vでは何％になるかを計算して希釈する方法(0.2%,W/V、作製方法は後述）
③85%のリン酸を2mLとって1Lにする方法

移動相条件の書き方と作り方が1対1で対応していないのはすっきりしません。

疑問１に関しては、10mM NaH₂PO₄, pH2.5(H3PO4)と書けば良いのです。 疑問２に関しては、％を書かないで、モル濃度で表せばいいのではないかと考えています。

ただし、計算することが必要になります。 0.2%V/Wは何モルか？ リン酸の分子量は97.995、比重は1.00として計算します。 1L中に含まれるリン酸の重量は、1000×0.2/100＝2.0gで、そのモル数は2/97.995＝0.020、20mMとなります。

次はどうやって作るかという話です。簡単です。 85%リン酸を425倍に希釈すれば良いのです。この方法だと、W/Wの0.2%になってしまいますね。 まず、85％(W/W)リン酸のモル濃度を計算します。比重は1.69で計算します。 1Lの重量は、1000×1.69=1690、1690gです。 この中のリン酸の量は、1690×0.85=1436.5、1436.5gです。 これをモル数に直すと、1436.5/97.995=14.66、14.66Mになります。 つぎに0.2%つまり、20mMの作り方を考えます。 85%リン酸何mLが20mMに相当するかを計算すればいいわけです。 0.02＝14.66×y, y=0.02/14.66=0.00136 1.4mLを1Lに希釈すればいいことになります。

実際のリン酸濃度に関しては、次回掲載します。

今が旬です！＜お茶＞ ／社員食堂の栄養士さんから（１２）

毎日お茶でホッとひと息という方もいるのではないでしょうか？

5月になると新茶が出回るようになります。お茶は栄養的にはテアニン、ビタミンC・B2、タンニン、カフェイン、フッ素などを含みます。

 そのため、口臭や虫歯の予防、胃腸の働きを活発化、ストレスへの抵抗力をつける、細胞のガン化を防ぐといった働きが期待できます。

ただし、タンニンは時間が経つと酸化がすすむので入れたてを飲む、カフェインが脳を興奮させるので寝る前は控える、それらの成分との関係から、薬とは一緒に飲まないといった点に注意しましょう。

今が旬です！＜じゃがいも＞ ／社員食堂の栄養士さんから（１１）

じゃが芋は１年中出回っていますが、春と秋から冬にかけての年２回が旬となります。

新じゃがと呼ばれるものは５月から６月にかけて九州から出荷されるもののことです。

栄養的には炭水化物が主成分ですが、カロリーは他のいも類より低いです。またビタミンCは加熱しても壊れにくい形で含んでいるため免疫力向上に役立ちます。

カリウムに関しては「王様」と呼ばれるほど豊富に含んでいるので、特に塩分を多く摂取している人は意識して食べるようにしたい食品ですね。

HPLC分析のコツ（9） 再現性の良い混合溶媒の作り方

今回は、再現性の良い混合溶媒の作り方についてお話します。

本題に入る前に、混合する精度がどの程度必要なのかを考えてみます。 混合比率の変化は保持時間の変化となってあらわれます。 一般に、高速液体クロマトグラフィーでは化合物の同定は保持時間のみで行われます。 移動相を作り直すごとに、保持時間が大きく変わるようでは困ります。 逆相クロマトグラフィーである化合物を分析した場合、アセトニトリル濃度10％と11％を比べると、 保持時間は13.7分から11.8分へ、約2分も動いたことがありました。0.1％の変化で0.2分（12秒）動くことになります。どのあたりを精度目標にするか、大変難しいのですが、0.1％～0.2％にしたいと思います。 上記の例の場合、0.5％では1分以上保持時間が動きます。これではあまりにも大きすぎます。かといって、0.05％を目標にすることは現実的に困難です。 例えば、1Lの移動相を作る場合、100.0mLと100.5mLを区別しなければいけないからです。

では、どのようにすれば、0.1％の精度で移動相を作成できるのでしょうか。ポイントは計量器の精度（最小目盛）です。 結論から言いますと、10％以下はメスピペット、メスシリンダーで作り、それ以上は天秤を使います。10％以下も天秤で計って移動相を作っても良いのですが、 使い慣れたピペット、メスシリンダーでも精度は出ます。

10％以下の例について記述します。100mLのメスシリンダーでは99mLと100mLを計り分けることができます。 一方、1Lにフィルアップするときに使うメスシリンダーでは、990mLと1000mLを計り分けることはできます。こうして出来上がった移動相の組成は9.9～10.1％の範囲に入ります。もっと少量の場合ではどうでしょうか。1％の場合、9.9mLと10mLは十分計り分けることができます。この場合、0.99％～1.01％となります。

今度は、10％以上について考えてみましょう。20％を0.1％の精度で作るには、199mLと200mLとの区別ができなければなりません。200mLのメスシリンダーでは、これが不可能です。最小目盛が2mLだからです。ここで電子天秤に登場してもらいましょう。これを使うと、200.1gと200.0gさえ計り分けることができます。あとは全量を1LにすればOKです。比重をもとに体積を重量に変換しておかなければなりませんが。

天秤を使ったことによって、新しい混合溶媒の表し方が出てきました。 重量％と重量比です。どちらもあまり見かけません。私の場合、 重量％で表示しなければいけないような作り方はしません。 重量比で作った場合でも、比重で計算して体積比として表示しています。

さて、ここで％表示と比率での表示について考えます。どちらが得かというお話です。2.9％を作ることは簡単です。29mLを1Lにメスアップすればよいだけです。ところが、97.1:2.9を作ることはできません。1Lのメスシリンダーで971mLを計りとるのは不可能だからです。このように考えると、量が少ないときは％表示の方がよさそうです。 天秤で作るのであればどちらも可能ですが、天秤で作るのは大変です。

％表示で混合溶媒を作るとき、注意して欲しいことがあります。 充分に混合してから、全容を1Lにして下さい。10％メタノールの場合、水500mL入れてメタノール100mLを加え、よく混合したのちに水を加えて1Lにしてください。 水900mLの上にメタノールを静かに加えて2層があまり混合しないように、注意深く1Lにする。こんなことは、しないでください。

金環日食

２１日の朝、関東地区は広い範囲で曇り空だったのですが、雲の晴れ間から時々、太陽が見え隠れしているような状態でした。金環日食を見ることができるかどうか微妙だったのですが、わずかな時間ではありましたが、太陽がその姿を現しました。